利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度

广得排程中营会变酸。对金属具有男性性。 项目八 发热产物的分离与精制 157

零盐制的加人量盐新剂的用量与所沉院的酶的种类和酶液中杂质的性质、数量有、商以收率高的用量为标准，具体用量需要通过对比实验和生产实践模索才能确定，度和pH值除了钛捐的种类外。盐析操作的温度和pH值是获得理型盐析沉

档重要因素。

些析时的温度选择要以不降低酶的活力为原则，既要考虑保持酬的稳定性，也要适当地考虑盐析效果，大多数蛋白质都在室下进行盐析。

数新的pH值选择也要以不降低酶的活力为原则，由于蛋白质在等电点时最容易沉淀。据此可选择等电点附近的pH值作为盐析pH，但为了防止pH值对胡活力的影响，可通过试验选择在酶稳定的pH值范围内进行盐析，

操作方式盐析时操作方式不同。会影响所需的盐量，也会影响沉淀物颗粒的大小.盐折操作条件要温和，不能引起蛋白质变性。

2.等电点沉淀法

利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分离的方法称为等电点沉淀法、等电点沉淀法主要用于一些水化程度不大，在等电点时解度很低的两性电暴质的产物中，例如生素，氨基酸以及疏水性的蛋白质如酪蛋白等，对于亲水性很强的生化物质，即使在等电点的pH值下,仍不产生沉淀，可与其他沉淀法结合起来进行。

与盐析法相比，等电点沉淀法的优点是无需后续的脱盐操作，但是，如果沉淀操作的 H值过低，容易引起目标蛋白质的变性。

3.有机溶剂沉淀法

在蛋白质溶液中，加人与水互溶的有机溶剂，能显著地减少蛋白质的溶解度而发生沉奖，有机溶剂沉淀法适用于蛋白质、酶、核酸等物质的提取。

(1)基本原理有机溶剂沉淀的机理主要是由于加人有机溶剂后，会使水与有机溶剂混合藏的分电常数减少，因而在不同蛋白质粒子表面上，具相反电性离子之间的吸引力增加，这就促使它们相互聚集，并沉淀下来，一般来说，蛋白质的相对分子量越大，有机溶剂沉淀越容易，所需加入的有机溶剂量也越少。

常用于生物大分子物质沉的有机溶剂有甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮等，其中乙醇是最常用的沉淀剂。因为它无毒，适用在医药上使用。

(2)影响有机溶剂沉淀效果的因素影响有机溶剂沉淀的因素是多方面的，如有机溶剂的种类和用量、沉的温度、pH值、时间以及溶液中的盐类等。

①有机溶剂的种类不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率，受蛋白质的种类、温度、pH值和杂质等因素所影响，选择溶剂的原则是所用的溶剂必须能与水互溶，但与产物如蛋白质等不发生反应,大致上以丙酮效果最佳，乙醇次之，甲醇更次。

②温度 有机剂沉时，温度是重要的因素。有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著减少，因此低温下，沉淀得完全，有机溶剂用量可以减少。温度升高，变性的危险随之而增大，为了防止蛋白质变性及利于沉淀完全，应在低温下沉淀。

pH值在产物结构稳定范围内，选择溶解度最低时的pH值，有助于提高沉淀效差，等电点时蛋白质溶解度最低，因此有机溶剂沉淀时，溶液pH值应尽量在蛋白质等电点附近，但是pH值的控制还必须考虑蛋白质的稳定性，例如许多酶的等电点在pH4~5，比其稳定的pH范围低，因此pH值应首先满足蛋白质稳定性的条件，不能过低。(二)萃取分离技术

利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同，而使溶质得到纯化或浓缩的方法称为

156 发置[线术

的纯度、常用的分离方法有沉淀法、萃取法、吸附法、膜分离技术和结晶与干燥技术等方法，

(一)沉淀分离技术

沉淀是通过改变条件或加人某种试剂，引起溶质的溶解度降低，生成固体凝聚物的现象，它具有设备简单、成本低、浓缩信数、收率高等特点。常用方法介绍如下。

1、盐析法盐析法又称中性盐沉淀法，在发酵液中加人高浓度中性盐能破坏蛋白质(或酶)的胶体性质、中和表面上的电荷、促使蛋白质(或酶)聚集成更大的分子团而沉淀。一般适用于蛋白质分离和酶制剂工业的发酵液粗提取。其主要优点是:无机盐不容易引起蛋白质变性失活，盐析过程中非蛋白的杂质很少被夹带沉淀下来，适用范围广，几乎所有的蛋白质和酶都能采用，设备简单，操作方便。盐析法的主要缺点是沉淀物中含有大量盐析剂，需要进行脱

盐处理,才能进行后续的纯化操作。

(1)盐析原理蛋白质(或酶)等生物大分子物质以一种亲水胶体形式存在于水溶液中、无外界影响时，呈稳定的分散状态。其主要原因是:蛋白质为两性物质，在一定的PH下表面显示一定的电性，由于静电排斥作用，使分子间表现为互相排斥而稳定;另外，蛋白质分子周围、水分子有序排列，在其表面上形成水化膜，水化膜层能保护蛋白质粒子，避免其因碰撞而聚集沉淀。

如果在溶液中加人一定量的中性盐，由于中性盐的亲水性比蛋白质(或酶)的亲水性大，盐离子在水中能与大量的水分子结合而发生水化，而使蛋白质脱去水化膜;同时由于中性盐的解离、中和了蛋白质(或酶)颗粒所带的电荷，颗粒间失去了相互的排斥力，在布朗运动下能够相互靠拢、聚集起来成为沉淀而析出。盐析机理如图8-6所示。

+

+

H OH

OH

H

pH<pL带正电荷 在等电点状态的

免水胶体又有水膜.是稳定的酶蛋白，水膜未脱，是不稳定的亲水胶体亲水胶体 pH>pI,带负电荷.又有水膜，是稳定的

中性盐

破坏水膜 破坏水膜 中性盐 中性盐

破坏水膜

中性盐中和其电荷 中性盐中和其电荷 一

SO等

NH或Na等

蛋白质沉淀

图8-6盐析机理示意

(2)影响蛋白质盐析效果的主要因素影响盐析作用的因素主要是盐析剂种类、盐析剂的加入量、溶液的pH值、温度、操作方式以及蛋白质(酶)的种类和浓度、搅拌等。①盐析剂的选择在蛋白质盐析中，一般阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价态阴离子更为明显。通常可以采用的盐析剂有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁和磷酸钾(钠)等。但是在实际应用中，硫酸铵是最常用的一种盐析剂。主要是因为硫酸铵价格便宜、溶解度大，而且受温度影响小，具有稳定蛋白质的作用。但它在较高pH值溶液中容易释放氨，在