发酵产物的分离与精制

项目八 发酵产物的分离与精制 151

原料也进行高度浓缩，从而使发酵产物的下游加工过程成本显著增加，

(3)失活问题 欲提取的产品的生理活性大多是在生物体内的温和条件下维持并发挥作用的、离体后通常很不稳定，当遇到高温、极端pH、有机溶剂等外界条件变化,会分解或失活。(4)具有一定的灵活性由于发酵是分批操作，生物变异性大，各批发酵液质量不尽相同，这就要求下游加工有一定弹性，特别是对染菌的批号也要能够处理。

(5)发酵最后产品对于纯度和安全性要求较高发酵产物一般用作医药、食品和化妆品，与人类生命息息相关，因此要求分离纯化过程纯度很高，同时要求去除原料液中含有的热原及有害人类健康的物质，并且防止这些物质在操作过程中从外界混人。

二、发酵液的预处理及固液分离

发酵液的预处理和菌体分离是从微生物发酵液中提取目的产物的第一个必要步骤，因为无论是胞内产物还是胞外产物，都涉及细胞的富集和固体悬浮物的分离除去，常用的固液分离方法主要是过滤和离心，包括菌体分离、细胞破碎、固体杂质的去除等步骤。如前所述，由于发酵液中组成成分复杂，目的产物的浓度较低，其中所含的各种杂质对目的产物的分离纯化能够造成很大的影响，因此在目的产物分离纯化之前必须进行发酵液的预处理。预处理的目的是改善发酵液性质，以利于固液分离，为纯化、精制做准备。

(一)发酵液的预处理

发酵液中杂质种类很多，含有大量可溶性胶状物质，主要是核酸、杂蛋白等，此外还有不溶性多糖，这些杂质不仅使发酵液黏度提高，固液分离速度受到影响，而且还会影响后面的提取操作。因此，应通过预处理尽量除去这些杂质。

1.凝聚和絮凝技术

凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使其聚集起来，增大体积，以便于固液分离，提高固液分离速度和滤液质量。在预处理中，常用于细胞、菌体(胞外产物)、细胞碎片(胞内产物)以及蛋白质等胶体粒子的去除。

(1)凝聚作用 凝聚是在中性盐的作用下，由于胶体粒子之间的双电子层排斥电位降低，而使胶体体系变得不稳定的现象。

发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面一般都带有电荷，带电的原理很多，主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。在生理状态pH下，发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用将溶液中带相反电荷(正电荷)的粒子吸附在周围，在界面上形成双电层，这种双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。双电层的电位越高，电排斥作用越强，胶体粒子的分散程度就越大，发酵液过滤就越困难。

如果在发酵液中加人具有相反电荷的电解质，就能中和胶粒的电性，使胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，因相互碰撞而产生凝聚。此外，由于电解质离子在水中的水化作用，会破坏胶粒周围的水化层，使其能直接碰撞而聚集起来。

电解质的凝聚能力可用凝聚值使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度(mmol/L)表示。根据叔米-哈第(Schulze-Hardy)法则，反离子的价数越高，该值就越小，则凝聚能力就越强，阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子的凝聚能力的次序为:AI+>F+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+ ，常用的絮凝电解质有:KAI(SO)z·12H2O(明矾)、 AICl.6H₂O、FeSO、FeCl、ZnSO、MgSO1。

(2)絮凝作用 絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂的作用下，在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的作用。

发置置技置术

累凝剂是水溶性的高分子聚合物。相对分子质量可达数万至一千万以上，它们具有长链152

结构,在长的链节上含有相当多的活性功能团，它们通过静电引力、范德华力或氢键的作用、强烈地吸附在粒表面，当一个高分子聚合物的许多链节分子分别吸附在不同颗粒表面

上，产生了架桥连接，就形成了较大的絮凝团，从而产生絮凝作用。

絮凝剂包括天然的聚合物和人工合成的聚合物，天然的有机高分子絮凝剂包括多糖类物质(如壳聚糖及其衍生物)、海藻酸钠、明胶和骨胶等，它们都是从天然动植物体内提取面得.无毒，使用安全，适用于医药和食品，人工合成的有机高分子絮凝剂包括聚丙烯酰胺类

粉生物、聚苯乙烯类衍生物和聚丙烯酸类等。

影响絮凝效果的因素很多，主要是絮凝剂的分子量和种类、絮凝剂的用量、溶液pH

值、搅拌转速和时间等因素。

2.去除杂蛋白的其他方法

(1)等电点沉淀法蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中，胶体粒子的稳定性和其所带的电荷有关，与氨基酸等两性物质一样，蛋白质所带的电荷可因溶液pH值的不同而变化,在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷，而在某一pH值下净电荷为零，溶解度最小，容易产生沉淀而除去，我们将之称为等电点沉淀法。

由于蛋白质的羧基电离度比氨基大，故蛋白质的酸性常常强于碱性。因此大多数蛋白质的等电点都在酸性范围内(pH4.0~5.5)。有些蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，单靠等电点沉淀的方法还不能将所有杂蛋白去除，通常还要结合其他方法。

(2)变性沉淀蛋白质从有规律的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质溶解度较小，最常用的蛋白质变性方法是加热，加热还能使液体黏度降低，加快过滤速度。但是热处理通常对原液质量有影响，特别是会使色素增多，该法只适用于对热较稳定的生化物质，因此加热的温度和时间必须严加选择，否则容易使其破坏。

使蛋白质变性的其他方法还有:大幅度改变pH值、加乙醇或丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。加有机溶剂使蛋白质变性的方法成本高，通常只适用于处理量较少或浓缩液的场合。

(3)加各种蛋白质沉淀剂沉淀加某些化学试剂，使蛋白质与之形成复合物沉淀，也是一种除去杂蛋白的方法,在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀;在碱性溶液中，能与一些阳离子如 Ag*、Cu*、Zn、Fe*和 Pb+等形成沉淀。

(4)吸附利用吸附作用也能有地除去蛋白质。例如在提取四环类抗生素中，采用黄白质。

血盐和硫酸锌等协同作用，生成亚铁氰化锌钾K2Zns[Fe(CN)6]z的胶状沉淀，可吸附蛋

3.高价态金属离子的去除

预处理时应将它们除去。 对提取和成品质量影响较大的无机杂质主要是Mg2+、Ca2+、Fe2+等高价态金属离子，

(1)去除钙离子常采用草酸钠或草酸，反应后生成的草酸钙在水中的溶解度很小，因此能将钙离子较完全地去除，生成的草酸钙还能促使杂蛋白凝固，提高滤速和滤液质量。

尽铁离子;还可采用磷酸盐，使其生成磷酸镁沉淀而除去。 (2)去除镁离子去除镁离子也可用草酸，但草酸镁的溶解度较大，故加入草酸不能除

(二)发酵液的固液分离

(3)去除铁离子要除去铁离子，可加人血盐，生成普鲁士蓝沉淀而除去。

固液分离的目的包括两方面:收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相;